②每孔加入10 μL（加入量为培养基的10%）的CCK8试剂（注意不要产生气泡，会影响OD值的读数），37℃ 5% CO₂孵育1~4小时。

③用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。（如暂时不能测定OD值，可向每孔加入10 μL的0.1M的HCL溶液或3%的SDS溶液并遮光保存在室温条件下或者直接将培养板放置到4℃，24小时内测定，OD值不会发生改变）。

④根据每孔的细胞数量及测定的OD值做出“细胞数量-OD值”曲线图，即可得出对应细胞的活力。

2）细胞增殖-毒性实验步骤

①预实验（只针对 次实验的细胞）：

a.收集对数生长  期细胞，先根据细胞扩增传代时的细胞生长速度同比列计算出细胞生长84小时后汇合度达到100%时的细胞铺板密度，然后以之作为中心密度，以1.25倍为梯度，往/往后各梯度稀释4个密度，种到实验所用类型的细胞板中；

b.并按实际实验过程模拟给药（同比列加入溶媒的培养基），37℃ 5%  CO₂ 培养箱培养72小时后加CCK8试剂，37℃ 5%  CO₂孵育1~4小时后测定OD值；

c.根据OD值及培养板中细胞的实际汇合度确定终实验铺板细胞密度。

②收集对数生长  期的细胞，根据预实验结果稀释好细胞悬液，以50 μL/孔接种到96孔板中（384孔板为25 μL/孔），37℃ 5%  CO₂ 培养过夜（悬浮细胞铺板后即可加药）。

③待细胞完  全贴壁后每孔加入50 μL/孔（384孔板为25 μL/孔）的待测工作液，37℃ 5%  CO₂继续培养72小时。;

④每孔加入10 μL（384孔板为5 μL）的CCK8试剂（注意不要产生气泡，会影响OD值的读数），37℃ 5%  CO₂ 孵育1~4小时。

⑤用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。（如暂时不能测定OD值，可向每孔加入10 μL的0.1M的HCL溶液或1%的SDS溶液并遮光保存在室温条件下或者直接将培养板放置到4℃，24小时内测定，OD值不会发生改变）。

⑥数据计算%抑制率=(1- (ODS- ODBLK ) / (ODNC –ODBLK ))×100%

其中：

ODS：样品孔的吸光值（细胞+待测化合物）

ODNC：阴性孔吸光值（细胞+溶媒）

ODBLK：空白孔吸光值（培养基+溶媒）实验结果

原创作者：上海陶术生物科技有限公司